5 月10 日，尊王排外派斗士高杉晋作，首先在长州向西方侵略者发起攻击，炮击了经过马关的美国商船，这艘商船被打得差一点沉没，东倒西歪地逃走了。他们急忙兴奋地向天皇报功。美国公使当即向德川幕府提出抗议，要求他们管好各地的诸侯。德川幕府闭口不提孝明天皇的排外指示，把炮击事件说成是地方诸侯在发动内乱，并暗示外国人可以按自己的意愿行事。这就等于是出卖了长州。于是美国和法国的海军立刻进行了残酷的报复，击毁了长州海岸的全部74 门大炮。为防止外国侵略者更大规模的军事报复，高杉晋作担起了防守马关的重任。高杉晋作曾经到中国的上海进行考察，一方面，他亲眼看到了中国沦为半殖民地社会的教训，另一方面，他也更清楚地了解到西方资本主义发展的历史和当时的国际形势，认识到盲目排外、闭关锁国并不能使国家强盛起来，正确的道路应该是一边改革国内腐朽的幕府政治，一边学习资本主义的富国强兵之术。他认为过去的武士己不能适应今天的战争需要，所以打破了日本历史上不许武士以外的平民参军的传统，从农民、渔民这些普通老百姓中招募了大量兵士，进行严格的训练，组成了一支战斗力很强的“奇兵队”。后来，这支队伍在抵御外敌和打击幕府上起了很大的作用。

孝明天皇得到外国军队攻击马关的消息后很愤怒，在8 月13 日发布诏书，宣布要亲自出征，去与西方侵略者作战。为此，孝明天皇决定在8 月18 日去祭莫祖先神灵，希望能得到祖先和神灵的保佑。

一旦天皇的计划得以实现，就等于让尊王排外派掌握了全国的军事和政治大权，就在这个关键时刻，德川幕府和顽固派迫不及待地进行了反扑。他们在8 月17 日深夜至18 日凌晨发动了宫廷政变，把尊王排外派的大臣以及长州等地的尊王排外派武士2600 多人赶出了京都。一些尊王排外派的领袖被逮捕甚至被处死，孝明天皇又落入了幕府的控制之中。这个时候，天皇个人究竟是什么政治主张已经无关紧要了，无论谁把天皇抓在手中，都可以用天皇的名义号令天下。所以一夜之间，京城又成为幕府和顽固派的天下，朝廷中的重要职位都换上了幕府的大臣。这次政变被称为“八一八政变”。

尊王排外派的武士只得撤往长州，重新聚集力量。过去，他们始终认为，自己是按照孝明天皇的旨意行动的，是天皇的忠臣义士。可是现在，他们却被赶出了京城，他们感到自己是被孝明天皇出卖了，于是不断发动反攻，企图打败幕府，夺回京城。1864 年7 月，以长州的改革志士为核心的尊王排外派力量，攻入京城，与幕府军在皇宫禁门展开了激烈的战斗，枪炮声、厮杀声响成一片。改革派希望能够攻入皇宫，把孝明天皇抢到自己手中，这样他们就有了号令全国的力量。这时孝明天皇与皇后、太子躲在宫殿中，被不时传来的震耳欲聋的枪炮声吓得魂不附体，他甚至已经让人抬来了御轿，随时准备逃离皇宫。但是，尊王排外派的军队终究没能攻进皇宫，最后还是被幕府军打败了。德川幕府立刻进行反攻，以“进攻皇宫”这个“大逆不道”的罪名，调动全国的军事力量讨伐长州。与此同时，英、法、美、荷4 国也组成联合舰队，向长州的马关发动进攻。长州的改革派军队抵挡不住，当地的诸侯向幕府投降，尊王排外派力量四散逃走，坚持了4 年多的尊王排外运动到此结束。

但是，日本的改革运动不但没有结束，而且在这次血与火的洗礼中得到了提高。1865 年1 月，以高杉晋作为首的“倒幕派”走上了历史舞台，他们认识到，天皇和诸侯都是靠不住的，盲目排外也是行不通的，日本改革的第一步，首先就是要打倒幕府。他们在马关发动了起义，经过3 个月的艰苦奋战，重新夺回了长州的控制权。从此，日本国内的政治局面发生了根本性的变化。