恩里克国王后来知道妹妹与斐迪南王子私订了终身，气得暴跳如雷，他以不服从王命为由，下令拘捕伊莎贝拉。公主闻讯逃往马德里加尔，后又在一名大主教的帮助下出逃到奥卡尼亚。渴望统一和安定的老百姓们，得知公主与斐迪南王子将结成良缘的消息后，奔走相告，纷纷前来帮助公主对抗国王。当国王的军队来逮捕伊莎贝拉时，奥卡尼亚的人民走上街头，高呼：“卡斯提尔——阿拉贡！”他们挥舞着两国的旗帜，截住国王的军队，使伊莎贝拉得以逃脱，躲到一个秘密地方。

公主知道，自己躲藏的地方迟早会被国王的军队发觉，于是，她又派信使去通知斐迪南王子，说是情况紧急，请他务必乔装潜来她的隐藏地，马上举行婚礼，造成既成事实，使恩里克国王奈何不得。王子得讯后，化装成一个挑夫，混在一个商队里潜来伊莎贝拉住地。王子这时只有17 岁，他比公主小11 个月。两个有情人终于相会了。1469 年10 月，他们在巴里阿多里德的胡安比维罗宫里举行了盛大的婚礼。

恩里克国王得知公主和斐迪南正式结婚的消息后，勃然大怒，扬言要发兵讨伐。伊莎贝拉一再上书申辩，并一再表示愿意继续效忠国王，但国王却置之不理。由于伊莎贝拉一直住在支持她的省区里，国王也拿她没有办法。

第二年，公主生了一个女儿，取名也叫伊莎贝拉。后来在罗马派到西班牙的大主教的调解下，恩里克才和他的妹妹伊莎贝拉言归于好。

虽然恩里克反对妹妹的婚姻，但他并没有剥夺她的继承权，也没有说让乔安娜公主继位。优柔寡断的国王，直到1474 年12 月12 日逝世，也未明确表示最终由谁来继承王位。他死的那天，伊莎贝拉正在塞哥维亚市，这里离马德里大约90 公里。当时，她的丈夫斐迪南恰好回阿拉贡去平息叛乱，为年迈的父王解围。伊莎贝拉手持兄长去世的讣告，心里有些矛盾：是否等丈夫回来再继位？但诚心诚意拥护她的塞哥维亚市民们，却等不及了，他们拥到公主住的宫殿，提出要她立即即位的请求。于是，她当机立断，决定第二天就举行登基加冕仪式，以免出现王位继承的纷争。

第二天，身穿洁白丧服的伊莎贝拉来到等候多时的塞哥维亚市民面前。

她骑着马来到大教堂。她外貌俊美，看起来既威严又坦诚。当她戴上王冠，宣誓就位，坐上卡斯提耳国王宝座时，人们连声高呼：“伊莎贝拉女王万岁！” 这一天，她时年23 岁7 个月零20 天。

不出伊莎贝拉和支持她的统一派贵族所料，加冕仪式一旦举行，许多城镇乡村都倒向塞哥维亚，议会也立即承认了伊莎贝拉的女王地位。只有顽固坚持自己封建特权的大贵族对此十分不满，他们决定勾结葡萄牙国王阿方索，让阿方索与乔安娜公主结婚，并把乔安娜扶上王位，以与伊莎贝拉争夺卡斯提耳的统治权。这时，乔安娜只有15 岁，而阿方索五世已快50 岁。葡萄牙国王所以要娶这个年幼的公主，主要是想夺取卡斯提尔的王位。

阿方索与乔安娜订婚后，就在1475 年5 月率领两万多军队越过葡卡边境，占领了帕伦尼亚。反对伊莎贝拉的力量汇集到他的大旗下。而年轻的伊莎贝拉女王，一没有军队和足够的金钱，二没有作战经验，但她具有一种不屈服于外力的决心和毅力。她和丈夫斐迪南四处奔走，号召人民奋起保卫自己的国土，很快便组织起一支4 万人的军队。卡斯提耳人民对胡安二世和亨利四世这父子俩的昏庸统治早已深恶痛绝，更不愿意让一个在外族扶植下的国王再骑到自己的头上，因此，他们一致支持伊莎贝拉女王，在战争中表现得异常英勇。经过4 年的战争，1479 年初在托罗的决战中，卡斯提耳军队彻底打垮了阿方索的军队。2 月24 日双方签订了《特鲁西略条约》，条约规定解除阿方索五世与乔安娜的婚约，葡萄牙军撤出卡斯提耳。